Tissu musculaire squelettique (cellules satellites)
I
- Gillian Butler-Browne
Vincent Mouly
II
- Didier Montarras
Christian Pinset
1- Définitions générales :
La cellule souche, qu'il s'agisse de cellules présentes aux
stades précoces (ES et/ou EG), plus tardifs ou après la naissance, représente
une réserve susceptible de reformer des tissus lésés ou dégénérés. Il
convient de dissocier les différentes cellules utilisables à des fins thérapeutiques
selon leurs caractéristiques, en s'appuyant sur les définitions existantes,
issues du système hématopoïétique :
-
cellules souches vraies : ces cellules présentent deux
propriétés. En effet, elles sont diploïdes (exclusion des gamètes) et sont
capables d'auto-renouvellement. Ce dernier point est plus complexe qu'il n'y
paraît, car ces cellules étant indifférenciées, elles doivent conserver la
propriété de donner d'autres cellules (pluripotentes, multipotentes ou
unipotentes, voir ci-dessous). D'autre part, elles doivent aussi conserver la même
capacité à proliférer afin de ne pas épuiser le système. Nous reviendrons
sur ce point, mais on notera qu'une caractéristique qui est apparue récemment
concerne la capacité de réguler leur horloge mitotique (l'horloge mitotique détermine
le nombre de divisions que fera toute cellule humaine avant d'atteindre la
senescence proliférative).
-
cellules multipotentes ou pluripotentes : ces cellules sont généralement
issues de cellules souches et peuvent donner plusieurs descendances capables
d'exprimer des programmes de différenciations distincts selon leur
environnement. Cette dernière classe de cellules est plus aisément manipulable
que les cellules souches vraies, qui sont très difficiles à isoler et à
maintenir dans un système de culture in vitro. Par contre, leur horloge
mitotique n'est pas nécessairement contrôlée, et donc le nombre de divisions
qu'elles peuvent réaliser peut être limité, bien que généralement beaucoup
moins que les cellules unipotentes. Enfin, il faut noter que certaines cellules
issues de cellules souches ne donneront qu'un nombre très limité, voire un
seul type de différenciation (cas de la peau).
- cellules unipotentes : ces cellules sont déjà engagées dans une voie déterminée
de différenciation, et présentent toujours une capacité proliférative limitée.
Elles sont par contre directement mobilisables pour la réparation du tissu
auquel elles appartiennent, contrairement à la majorité des autres types
ci-dessus, qui ont besoin de signaux de détermination. Dans le muscle
squelettique, il s'agit des cellules satellites, qui sont les seules capables de
réparer efficacement les fibres musculaires lésées.
2 - Particularités du système musculaire squelettique :
Les cellules de
remplacement du tissu musculaire squelettique sont les cellules satellites, qui
ne sont pas à proprement parler des cellules-souches. Elles sont immédiatement
activées en cas de lésion traumatique ou pathologique, et représentent un
moyen de réponse à ces traumatismes très rapide et très efficace, dans la
mesure où elles sont déjà déterminées vers la voie de différenciation
musculaire. Par contre, leur capacité proliférative, qui diminue avec l'âge
et surtout en pathologie dégénérative, reste toujours limitée. Le nombre de
divisions disponible reste suffisant pour assurer leur fonction chez un individu
"normal" tout au long de sa vie, et ce malgré l'allongement de l'espérance
de vie. Par contre, il n'est pas suffisant pour répondre soit à des situations
pathologiques ou des cycles de régénération successifs sont nécessaires
(maladies génétiques dégénératives), soit à de nouveaux besoins thérapeutiques
(thérapie génique à médiation cellulaire (voir paragraphe suivant). Leur
manipulation en culture ne pose a priori pas de problèmes, dans la mesure où
il s'agit d'un système étudié depuis de nombreuses années et les conditions
de culture in vitro pour ces cellules ont été bien déterminées, tant chez
plusieurs modèles animaux que chez l'homme (en partie par notre équipe dans ce
dernier cas).
3 - Aspects thérapeutiques :
L'utilisation de cellules exogènes pour reformer un tissu défaillant (réparation)
ou pour corriger un défaut génétique est une voie thérapeutique qui fait
l'objet de recherche depuis de nombreuses années (voir les travaux pionniers
d'A. Caplan dans le domaine osseux et cartilagineux, ou ceux de J. Bernard pour
les cellules sanguines). Concernant le muscle squelettique, trois approches sont
à considérer :
-
régénération d'un tissu défaillant : c'est ce qui a été
proposé récemment par le groupe de Turnbull dans le cas de myopathies
mitochondriales dues à une accumulation de mutations dans le génome des
mitochondries des fibres musculaires. Une simple étape de régénération
permet d'apporter un stock de mitochondries saines issues des cellules
satellites et donc de corriger le problème.
-
correction d'un défaut génétique musculaire : de
nombreux essais d'injections de myoblastes modifiés ou non chez la souris ont
prouvé la validité de cette approche. La capacité proliférative limitée des
cellules satellites humaines représente toutefois un obstacle majeur à résoudre,
dans la mesure où les cellules doivent être isolées, éventuellement modifiées
puis injectées, sachant que cette dernière étape provoque une mort cellulaire
massive.
-
production d'un facteur circulant : la démarche, de type
usine cellulaire, est envisagée, et par exemple l'équipe d'H. Blau a déjà réussi
à faire produire par le muscle, chez la souris, de l'hormone de croissance que
l'on peut doser dans la circulation.
Dans tous ces cas de figures, une prolifération limitée par l'horloge
mitotique représente chez l'homme un problème qu'il faudra surmonter.
L'utilisation récente chez la souris de cellules souches (ou pluripotentes)
soit dans des expériences de greffes de moelle (groupes de G. Cossu et F.
Mavilio), soit après purification à partir du muscle lui-même (groupes de L.
Kunkel et R. Mulligan) a apporté de nouveaux espoirs.
4 - Quelques problèmes à résoudre :
Pour résumer brièvement les problèmes posés par la thérapie génique
en environnement musculaire, soit on utilise des virus comme vecteurs, ce qui
limite pour l'instant la quantité de séquence transférable, pose le problème
de ciblage et provoque souvent des rejets immunologiques, soit on utilise les
cellules musculaires (satellites ou "souches"). Dans ce dernier cas,
l'utilisation des cellules du patient nécessite de les modifier génétiquement
et de les réinjecter, ce qui représente une prolifération importante, soit on
utilise des cellules de donneurs sains, avec la conséquence d'un rejet
probable.
La possibilité de disposer de cellules souches, soit en les isolant à
partir des patients, soit en modifiant des cellules satellites pour leur conférer
des caractéristiques de cellules souches (manipulation de l'horloge mitotique)
représenterait donc une solution possible. Un certain nombre de problèmes
reste à régler :
-
le contrôle de la capacité proliférative, qui jusqu'à
présent n'a pas été réalisé avant les essais thérapeutiques, ce qui a
probablement contribué à leur échec prévisible.
-
l'efficacité des cellules souches à participer à la régénération
du muscle : dans les deux cas d'exemples cités ci-dessus (transfert de moelle
ou purification), les expériences chez la souris ont montré que cette
efficacité (inférieure à 1%) restait beaucoup trop faible pour avoir un
quelconque effet thérapeutique.
-
de telles cellules souches n'ont pas encore été
clairement mises en évidence chez l'homme, et l'existence de maladies dégénératives
semble indiquer que leur mobilisation n'est pas un phénomène courant, voire prévu
dans le fonctionnement normal du muscle squelettique.
-
elles sont réfractaires pour le moment à des
manipulations in vitro, particulièrement des amplifications de population
cellulaire.
5
- Quelques voies de recherche pour résoudre ces problèmes
:
Au vu des observations récentes et des problèmes à résoudre, dont la
liste présentée au paragraphe précédent n'est probablement pas exhaustive,
on peut mieux définir des voies d'approche vers une utilisation thérapeutique
du système. Ainsi, si de nombreux marqueurs de surface ont été définis dans
le système hématopoïétique, il existe beaucoup moins de données dans
d'autres systèmes, particulièrement dans le système musculaire. Tant que nous
ne sommes pas capables d'identifier et de purifier les cellules souches, les expériences
se cantonnent à des essais empiriques dont l'efficacité est nécessairement très
limitée par rapport aux capacités théoriques du système. Les voies
d'approche à développer nécessitent des connaissances de base qu'il faut soit
améliorer, soit tout simplement acquérir dans les domaines suivants :
-
marqueurs de surface : il existe très peu de marqueurs de
surface des cellules satellites (N-CAM qui n'est pas spécifique, M-Cadherine).
Il n'en existe aucun pour les cellules souches du tissu musculaire. Celles-ci
sont définies pour l'instant a posteriori selon des critères fonctionnels, ce
qui rend leur identification a priori et leur manipulation excessivement aléatoire.
Ces marqueurs seront absolument essentiels pour permettre une mise en évidence
des cellules souches chez l'homme dans les tissus ou ces données manquent,
ainsi que pour envisager une purification de ces cellules.
-
facteurs de détermination : on connaît déjà quelques
facteurs intervenant de façon précoce dans la détermination des cellules
musculaires (Myf5, MyoD), mais ces connaissances doivent encore être améliorées
afin de comprendre les événements qui déterminent l'orientation des cellules
souches vers un programme ou un autre. Ces connaissances viendront du domaine de
recherche sur le développement embryonnaire, et pourront être testées sur les
cellules souches précoces (ES ou EG), en attendant que des cellules souches
puissent être identifiées et manipulées chez l'adulte.
-
équilibre prolifération/différenciation : La capacité régénérative
du tissu musculaire, ou d'autres tissus non prolifératifs, dépendra en partie
de la décision des cellules de remplacement de proliférer ou d'entrer dans le
compartiment post-mitotique vers la différenciation. Cette décision aura une
influence sur la quantité de tissu formé, ainsi que sur le nombre de cellules
susceptibles de rester en réserve dans le compartiment à capacité mitotique.
Peu de données existent à ce sujet, et l'étude des cellules souches (qui sera
ici encore largement dépendante de données venant du développement
embryonnaire) apportera beaucoup d'informations dans ce domaine (par exemple les
recherches sur des facteurs antagonistes des facteurs de détermination. On peut
citer comme exemple simplificateur des gènes de la famille GATA).
-
contrôle du niveau de prolifération : Notre connaissance
de l'horloge mitotique a été améliorée par les résultats des recherches sur
les séquences télomériques. L'application de ces données aux démarches thérapeutiques
n'est pas encore réalisée, mais on peut espérer que ce sera chose faite dans
un avenir limité. Par contre, on ne sait pas encore manipuler cette horloge
dans des tissus à devenir post-mitotique comme le tissu musculaire ou les
cellules nerveuses. Les expériences utilisant des gènes comme celui de la télomérase
doivent être continuées et profiter des données concernant la sortie du cycle
cellulaire acquises ou à venir.
-
manipulation des cellules souches : Ces cellules étant
trop souvent réfractaires à la manipulation en culture (dans la mesure ou il
s'agit de cellules de réserve, on comprend qu'elles ne soient pas aisément
mobilisables), il faut améliorer nos connaissances dans les facteurs nécessaires
à leur manipulation in vitro. Des conditions de cultures adaptées particulièrement
à ces cellules devront être recherchées de novo, puisque les conditions
actuelles ne sont pas satisfaisantes.
-
tests fonctionnels : Toutes les connaissances acquises
selon les voies décrites ci-dessus permettront de mieux connaître les cellules
souches. Toutefois, pour pouvoir les utiliser à des fins thérapeutiques, il
est essentiel de pouvoir disposer de tests fonctionnels de leur capacité régénérative.
Le modèle de souris, déjà largement utilisé, pourra ici encore être très
utile. Ainsi, nous utilisons au laboratoire des souris "humanisées"
pouvant recevoir des injections de cellules humaines sans rejet immunologique.
Ce type d'outil permet de tester les capacités des cellules dans un
environnement in vivo bien plus proche des réalités thérapeutiques qu'une
boite de culture.
6- Conclusion
Il est clair que plusieurs domaines doivent être mis à contribution
pour améliorer nos connaissances et évoluer plus rapidement vers une
utilisation thérapeutique. Certains pays, dont il faut bien dire que la part du
PIB consacrée à la recherche est bien souvent supérieure à celle de la
France, sont déjà en avance sur ce sujet, et la compétition internationale nécessite
des efforts accrus. Les cellules souches embryonnaires représentent déjà des
modèles d'étude qui permettront de gagner beaucoup de temps, même s'il faut
toujours relativiser ce qui est observé sur ce type de modèle. Dans la mesure
où peu de modèles de cellules souches ont été décrits et sont manipulables
chez l'adulte, il est essentiel de profiter de toutes les possibilités. De même,
les connaissances venant du développement embryonnaire et des facteurs précoces
se sont déjà révélées très précieuses, et ce domaine doit être largement
soutenu. Les cellules souches adultes sont très prometteuses en terme d'outils
thérapeutiques, mais malheureusement encore trop peu accessibles pour permettre
une avancée rapide dans ce domaine. De plus, le caractère pluripotent des
recherches transdisciplinaires qui profiteront de la multiplicité des modèles,
y compris les cellules embryonnaires précoces.
Didier Montarras et Christian Pinset
Notre objectif est de définir des environnements ex vivo, basés sur des
combinaisons de facteurs de croissance, pour la sélection, l'amplification, et
la différenciation de cellules souches. Cette démarche est indispensable pour
le développement de la thérapie cellulaire par transplantation.
1 - Types de modèles cellulaires utilisés
Cellules précurseurs des muscles du squelette
2 - Potentiel de différenciation
Ces cellules sont mono-potentes. Elles manifestent, en culture et in
vivo, la capacité de reformer des fibres musculaires.
3 - Capacité de mise en culture
Ces cellules sont aisément mises en culture. Elles sont dérivées des
cellules myosatellites. Les cellules musculaires souches persistent dans les
muscles à l'état adulte.
(4-5) - Besoin
nutritionnel en cultures et propriétés
Ces cellules peuvent proliférer et se différencier en culture dans des
milieux supplémentés avec du sérum. Nous considérons que, à terme (d'ici
quelques années), l'usage du sérum devra être éliminé, certainement pour
des raisons sanitaires mais aussi pour des raisons de compréhension. Dans ce
sens, nous travaillons à la définition de milieux de culture supplémentés
avec des combinaisons de facteurs de croissance recombinants. Nous avons déjà
élaboré des stratégies " recettes " qui permettent la prolifération
prolongée et la différenciation de cellules précurseurs des muscles du squelette d'origine murine et humaine.
6 - Destin des cellules réimplantées
De nombreuses réimplantations de cellules précurseurs des muscles ont
été effectuées chez l'animal. Ces cellules sont couramment réimplantées
directement dans les muscles par injection à la seringue.
Le destin de ces cellules est double : La majorité d'entre elles meurent
dans les 24 h qui suivent. Une
minorité de cellules persiste et manifeste la capacité de coloniser des fibres
musculaires dans les semaines qui suivent. Les raisons de cette mort massive et
rapide sont incomprises. Le nombre de cellules transférées souvent élevé
(plusieurs millions) et l'état cellulaire influencé par les conditions de
culture pourraient être en cause. Ce sont des questions que nous étudions.
7 - Plasticité
La transdifférenciation de ces cellules est possible. Elles peuvent
adopter un destin adipocytaire ou ostéogénique. Ce dernier se manifeste
lorsque les cellules sont cultivées sur matrice osseuse ou traitées par du BMP
(bone morphogenetic factor).
8 - Voie
d'accès au tissu cible
Injection directement dans le muscle.
9 - Utilité des cellules précurseurs des muscles du squelette dans une démarche thérapeutique.
C'est le type cellulaire le plus adapté pour la réparation des muscles
du squelette pour sa capacité réplicative et son caractère monopotent.
Ce type cellulaire pourrait être adapté à la réparation d'autres tissus tels que le muscle cardiaque et certains sphincters. Des essais dans ce sens sont entrepris par plusieurs équipes en France et à l'étranger. Une équipe française a réalisé cette année (été 2000) la première greffe autologue de cellules musculaires dans le cœur d'un patient atteint d'un infarctus.
10-11 - Commentaire général.
L'exposé succinct qui précède traite des cellules précurseurs des
muscles du squelette en tant que type cellulaire prédominant dérivé des
cellules myosatellites responsables de la régénération
musculaire.
Actuellement toutes les démarches de thérapie cellulaire s'appuient sur
des cellules souches ou précurseurs, au potentiel restreint. Ces cellules
proviennent du tissu que l'on cherche à réparer et leur destin est en quelque
sorte déjà fixé.
Récemment, la présence de cellules souches, au potentiel plus large, a
été décrite dans plusieurs tissus adultes, muscle du squelette, moelle
osseuse, système nerveux central. Le destin de ces cellules dépendrait de leur
site de réimplantation.
Aujourd'hui, maîtriser l'isolement, l'amplification et le contrôle du
devenir de ces cellules souches, mais aussi des cellules souches embryonnaires
(animales et humaines) est sans aucun doute un objectif majeur. Pour atteindre
cet objectif il est indispensable de faire de la culture cellulaire, une
technologie. Il va s'agir d'éliminer des milieux de culture, les sérums
animaux qui constituent encore aujourd'hui la principale source de facteurs de
croissance. Ces sérums devront être remplacés par des cocktails de facteurs
de croissance recombinants. Définir les combinaisons de facteurs de croissance,
requises pour gouverner l'engagement d'une cellule souche dans différents
lignages, est une tâche essentielle.
Les mots clés : amplification ex vivo, facteurs de
croissance, contrôle de la plasticité, thérapie cellulaire.
La biologie du développement bénéficiera de ces travaux. De nouvelles démarches de thérapie cellulaire pourront aussi naître.