I- Yann Barrandon
Directeur de Recherche
II- Jean-Paul Renard
Directeur de Recherche INRA
Cellules
souches cutanées et thérapie cellulaire
Yann Barrandon
Trois types cellulaires cutanés sont utilisés en thérapie
: les kératinocytes, cellules épithéliales responsables du rôle de barrière
de la peau, les fibroblastes, cellules mésenchymateuses responsables de la
production des fibres de collagène du derme et les mélanocytes responsables de
la pigmentation.
Certains
kératinocytes, appelés keratinocytes clonogéniques
(Keratinocyte colony-forming cells, K-CFCs), sont capables de former des clones
en culture. C'est cette propriété
qui est utilisée pour fabriquer les épithéliums de culture qui sont
transplantés chez les grands brûlés. Les
kératinocytes clonogéniques sont présents dans l'épiderme et les follicules
pileux.
Les épithéliums de culture autologues permettent de
reconstituer de façon permanente la barrière cutanée. De
façon surprenante, le tissu conjonctif, présent sous l'épiderme greffé se réorganise
progressivement pour ressembler au derme papillaire.
Cette régénération du derme superficiel, qui n'est jamais observée
lors de la cicatrisation normale, résulte vraisemblablement de la
transplantation de fibroblastes dermiques présents dans les épithéliums de
culture.
Indications
A - Transplantation de cellules souches autologues
.
Traitement des brûlures profondes
(kératinocytes)
.
Chirurgie plastique et réparatrice (notion de capital "peau")
(kératinocytes)
.
Ulcères de jambes (kératinocytes)
.
Vitiligo (mélanocytes et
kératinocytes)
.
Cornée (kératinocytes du limbe)
B - Thérapie génique par transplantation de cellules
souches autologues transduites
.
Génodermatoses très invalidantes (Epidermolyses bulleuses)
(kératinocytes)
.
Production d'une protéine d'intérêt médical (hormone de croissance,
facteur IX, insuline) (kératinocytes et fibroblastes)
C - Thérapie cellulaire avec des kératinocytes et /ou des
fibroblastes allogéniques
.
Retard de cicatrisation (kératinocytes)
.
Remplacement de la peau de cadavre (kératinocytes et fibroblastes)
La thérapie cellulaire a permis de sauver des patients grièvement
brûlés (au 3ème degré sur plus de 95% de la surface corporelle) (accident du
travail, accident domestique, catastrophe). Les meilleurs résultats ont été
publiés par l'équipe du Dr Carsin, chef de service du CTB à l'Hôpital
Instruction des Armées Percy à Clamart.
La plupart des équipes de recherche travaillant dans le
domaine sont spécialisées dans la culture de cellules ou dans la biologie des
cellules souches (le plus souvent chez l'animal de laboratoire). A ma
connaissance, seules deux équipes au monde ont des compétences reconnues en thérapie
cellulaire et en biologie fondamentale des cellules souches cutanées (compétences
documentées par des publications de haut niveau) ; ce sont l'équipe du Dr
Michele De Luca à Rome et celle du Dr Yann Barrandon à Paris. Nous ne
connaissons pratiquement rien du devenir clinique et biologique des épithéliums
greffés. Cela est dû à la difficulté à mettre en place des essais cliniques
et à la difficulté à suivre les malades à long terme. La mise en place
d'essais cliniques nécessite des locaux agréés et des personnels en nombre,
condition particulièrement difficile à remplir dans une institution en pénurie
chronique. Il faut savoir que les études de recherches clinique et fondamentale
ne seront jamais réalisées dans un cadre industriel (expérience américaine,
problème de rentabilité, compétence en recherche fondamentale). C'est parce
que ces recherches ont été négligées qu'aucun progrès n'a été accompli
depuis 1984, date de la publication princeps par le groupe du Pr. Howard Green à Harvard (Gallico et coll., N. Engl J Med. 1984). La
seule amélioration, validée par un essai thérapeutique, a été
l'introduction d'une matrice de fibrine pour cultiver les kératinocytes (Ronfard
et coll., Transplantation, 2000). Face aux difficultés rencontrées par le
groupe de Yann Barrandon pour continuer le développement de la technologie
"fibrine" en France, le groupe du Dr De Luca (Italie) a pris le
relais.
1. Type de modèle cellulaire utilisé et espèce (humaine et/ou animale)
Kératinocytes, fibroblastes, mélanocytes et cellules de Langerhans
2.
Quels potentiels de différenciation peut-on obtenir : comparaison
cellules souches adultes vs. cellules souches embryonnaires dans votre modèle
d'étude ?
Chez la souris : on obtient tous les lignages épithéliaux
présents dans la peau à partir de cellules souches adultes
Chez l'homme : on obtient une régénération de l'épiderme
et du derme superficiel après transplantation de kératinocytes et de
fibroblastes autologues cultivés
3.Capacité de mise en culture des cellules souches adultes vs. cellules
souches embryonnaires.
Homme et rat (embryons et adultes) : on cultive sans problème
les kératinocytes et fibroblastes souches
Souris (embryons et adultes) : les kératinocytes sont extrêmement difficiles à cultiver. Les fibroblastes se cultivent sans problème.
4.
Besoins nutritionnels en cultures in vitro (type de milieu, facteurs de
croissance, etc).
Couche nourricière de fibroblastes de souris irradiés (Swiss
3T3 - J2)
Sérum de veau fœtal, facteur de croissance épidermique
(hrEGF)
Les milieux "définis" n'ont jamais permis
d'obtenir un résultat clinique
5.
Quelles propriétés (morphologiques, cytologiques et/ou moléculaires)
s'attachent à l'état de division et de différenciation des cellules de votre
modèle d'étude ?
Reconstitution d'un épiderme fonctionnel avec mise en place
de façon coordonnée de tous les programmes de prolifération et de différenciation.
Idem pour la cornée
6.
Destin de ces cellules lors d'un transfert in vivo chez l'embryon ou chez
l'adulte ?
Homme : Reconstitution d'un épiderme fonctionnel après
transplantation autologue chez l'homme
Souris : Morphogénèse cutanée (épiderme, follicules
pileux et glandes sébacées) après transplantation dans l'embryon de cellules
souches adultes chez la souris
7. Degré de plasticité (trans-différenciation ) ?
8.
Voies d'accès au tissu-cible chez qui l'on vise à produire un effet régénérateur
?
Biopsie cutanée ou limbique (œil)
9.
Utilité des cellules souches mises en œuvre dans votre modèle en thérapie
cellulaire et en thérapie génique : comparaison cellules adultes vs. cellules
embryonnaires - Type(s) de pathologie(s) humaine(s) susceptibles d'en bénéficier
?
Grands brûlés (plusieurs centaines de malades ont déjà
traités par thérapie cellulaire dans le monde entier)
Greffes de cornée
Thérapie génique
- Autologue (génodermatoses très invalidantes type épidermolyses
bulleuses, production d'une protéine d'intérêt thérapeutique, chirurgie
plastique, troubles de la cicatrisation)
- Allogénique (troubles de la cicatrisation)
Dans l'immédiat pas d'utilité des cellules souches
embryonnaires
10. Clonage thérapeutique (potentiel ou effectif).
Pas d'intérêt thérapeutique immédiat.
Grand intérêt en recherche fondamentale
1.
Type de modèle cellulaire utilisé et espèce (humaine et/ou animale)
Cellules souches pluripotentes embryonnaires de souris (ES)
Cellules somatiques différenciées :
-proliférantes : fibroblastes de souris et de bovin
-postmitotiques : kératinocytes bovins (murin en projet)
2. Quels potentiels de différenciation peut-on obtenir : comparaison
cellules souches adultes vs. cellules souches embryonnaires dans votre modèle
d'étude ?
Nous nous intéressons au potentiel de différenciation des
noyaux de ces cellules en les exposant à l'environnement cytoplasmique
d'ovocytes énuclées (clonage).
Nous montrons que les noyaux des cellules souches
pluripotentes ES, et ceux des cellules somatiques différenciées proliférantes
peuvent être remis dans un état totipotent, c'est-à-dire qu'ils sont
capables de donner des cellules qui en se spécialisant donneront
toutes les cellules de l'organisme.
Par contre, les noyaux des cellules somatiques différenciées
post-mitotiques semblent ne pouvoir retrouver qu'un état multipotent et non
totipotent
3.
Capacité de mise en culture des cellules souches adultes vs. cellules
souches embryonnaires.
4. Besoins nutritionnels en cultures in vitro (type de milieu, facteurs de croissance, etc.)
La capacité de se diviser un grand nombre de fois en culture
doit être distinguée de la capacité à conserver ou retrouver un potentiel de
différenciation.
Les noyaux des cellules souches pluripotentes embryonnaires
de souris semblent perdre leur aptitude à retrouver un état totipotent au delà
d'une vingtaine de passages. Par contre, les noyaux des cellules somatiques différenciées
(bovins) peuvent conserver une aptitude à retrouver un état totipotent après
plus de 20 passages.
Ces différences entre types cellulaires pourraient dépendre
de conditions de culture (affectant des modifications post-traductionnelles
comme par exemple la méthylation de séquences nucléotidiques). Nous tentons,
par une approche jusqu'alors empirique, de préciser quels sont les besoins
nutritionnels qui sont compatibles avec le maintien de l'aptitude à retrouver
un état totipotent. Un de nos objectifs est de partir de lignées "
clonales " de cellules donneuses de noyaux (kératynocyte) et de recourir à une approche de génomique
fonctionnelle (arrays déjà constitués) pour cribler ces conditions de culture
en relation avec la potentialité de développement des noyaux en
clonage.
5. Quelles propriétés (morphologiques, cytologiques et/ou moléculaires)
s'attachent à l'état de division et de différenciation des cellules de votre
modèle d'étude ?
Nous caractérisons l'état de différenciation par la
formation d'un épithélium trophoblastique et d'un tissu ectodermique (épiblaste),
et pour ce dernier par la formation d'un tissu endo et d'un tissu mésodermique.
Ces différents tissus sont aussi caractérisés par une batterie de marqueurs
moléculaires classiques.
6.
Destin de ces cellules lors d'un transfert in vivo chez l'embryon ou chez
l'adulte ?
7. Degré de plasticité (trans-différenciation ) ?
Les questions que nous posons sont les suivantes :
- quels sont les facteurs ovocytaires qui contribuent à redonner à un noyau de cellule différenciée un état
totipotent ?
- ces facteurs ovocytaires sont-ils requis ? Autrement dit ,
ne pourrait-on pas replacer un noyau dans un état pluripotent par des
modifications contrôlées de son environnement cellulaire ?
La maîtrise des techniques de clonage a été une première
étape de ce questionnement.
Nous tentons maintenant par une approche associant génomique
fonctionnelle, hybridation in situ et RNA inhibition de commencer à répondre
à la seconde en comparant l'état transcriptionnel de noyaux zygotiques issus
de noyaux différenciés à celui de noyaux zygotiques issus d'embryons fécondés
in vivo ou in vitro.
8. Voies d'accès au tissu-cible chez qui l'on vise à
produire un effet régénérateur ?
9. Utilité des cellules souches mises en œuvre dans votre
modèle en thérapie cellulaire et en thérapie génique : comparaison cellules
adultes vs. cellules embryonnaires - Type(s) de pathologie(s) humaine(s)
susceptibles d'en bénéficier ?
Le recours aux cellules souches ES de souris nous permet de
poser la question suivante :
Les cellules ES issues de blastocystes clonés ont elles le même
potentiel de différenciation in vitro que les cellules ES dérivées de
blastocystes normaux ?
La réponse à cette question est importante pour une éventuelle
utilisation thérapeutique du clonage somatique chez l'homme.
Pour l'instant, nous caractérisons le potentiel de développement
in vivo de ces blastocystes murins (voir ci dessous).
10. Clonage thérapeutique (potentiel ou effectif).
Un des principaux résultats du clonage est de montrer que
les perturbations de l'environnement nucléaire peuvent n'affecter la capacité
de division et de différenciation des cellules qu'une fois celles-ci déjà
engagées dans des lignages particuliers. Ainsi, chez la souris et le bovin, les
cellules issues de clonage peuvent se différencier apparemment normalement au
stade blastocyste mais, in vivo, la différenciation et la croissance de
certains tissus (comme par exemple le trophoectoderme) sont ensuite altérées.
Nous ne savons pas s'il en est de même in vitro. Un premier
article publié récemment par un équipe australienne (Munsie et al., Curr
Biol. 2000 10, :989-92) montre que les cellules " clonées ES "
peuvent se diviser en plusieurs dérivés.
11. Autres remarques ou spécifications.
- Il serait important de faire savoir notamment auprès des
nombreuses instances qui participent en ce moment à la réflexion concernant la
révision des lois de bioéthique de 94 que le terme de cellule souche adulte
demeure encore mal défini et qu'il y a plusieurs définitions concurrentes données
aux termes de totipotence, mutlipotence et pluripotence. Ces concepts "
flous " permettent le débat scientifique, mais ne peuvent, sans
explicitation être utilisés comme caution scientifique.
- J'ai utilisé pour ce texte les définitions données par
le NIH même si celles ci ignorent la distinction entre cellule embryonnaire et
cellule somatique, pourtant largement utilisée en Biologie du Développement