Laure Coulombel
Directeur de Recherche
QS 1 : modèle cellulaire :
Modèle utilisé dans l'équipe : le tissu hématopoïétique
humain essentiellement, moelle osseuse, sang de cordon, sang périphérique.
Questions posées : Peut-on identifier des cellules souches multipotentes humaines et analyser le contrôle de leurs propriétés par des signaux externes provenant de l'environnement médullaire ? Nous avons notamment démontré (1) qu'existent dans le sang de cordon humain des cellules qui, à l'échelon unicellulaire in vitro, produisent toutes les cellules sanguines, et sont capables d'établir une hématopoïèse active chez la souris immunodéficiente ; (2) que le contact avec les cellules stromales retarde la différenciation de cellules souches humaines de la moelle osseuse, et stimule transitoirement leur " autorenouvellement ".
Trois sources de cellules souches hématopoïétiques (CSH) existent chez l'homme : la moelle osseuse, le sang de cordon ombilical (physiologique) et le sang périphérique des patients adultes traités par chimiothérapie et/ou par des cytokines (celles-ci entraînant le passage des CSH dans la circulation). Toutes trois sont utilisées couramment en transplantation pour : (1) remplacer toute ou partie des lignées du système hématopoïétique dans des pathologies où il y a un dysfonctionnement d'une ou plusieurs lignées ; (2) pour pallier transitoirement le déficit en cellules matures qu'entraînent les traitements anticancéreux ; (3) plus rarement, comme cibles de stratégies de thérapie génique lorsqu'une allo- (auto)-greffe curative n'est pas possible.
Il faut savoir que la moelle osseuse contient d'autres
cellules souches que les CSH : des cellules souches mésenchymateuses, des précurseurs
endothéliaux capables de contribuer à une angiogenèse adulte, et d'autres
cellules contribuant à la régénération d'autres tissus (muscle, foie). Les
cellules souches mésenchymateuses, contribuent, elles, à la reconstruction
osseuse ou cartilagineuse, peuvent être amplifiées in vitro, et sont, à ce
titre, utilisées dans des essais thérapeutiques dans des pathologies
ostéoarticulaires,
ostéogenèse imparfaite, ou en chirurgie orthopédique.
QS 2 à 5 : Potentiel de différenciation, mise en culture et propriétés des cellules souches hématopoïétiques.
Si on adopte une définition stricte (la terminologie est très
" laxiste "), qualifier une cellule de " souche hématopoïétique
" revient à démontrer sa capacité de produire, après implantation in
vivo, toutes les cellules matures du sang, et ce pendant la durée de vie de
l'individu. L'existence de telles cellules a été démontrée in vitro et in
vivo chez la souris, et aussi in vitro chez l'homme, du moins dans le sang de
cordon.
Or, chez l'homme, le paradoxe est que ces propriétés ont été
définies a postériori sur l'observation du succès des transplantations de
moelle, soit dans un modèle murin syngénique (1960) soit chez l'homme à
partir de 1970.
Si le succès de l'utilisation des CSH en thérapeutique
humaine est indiscutable, rares sont les patients qui peuvent en bénéficier.
Les principales restrictions sont liées (1) à la barrière immunologique dans
le cas de greffes allogéniques, (2) à la pathologie elle-même, (3) surtout à
la difficulté d'accroître le nombre des CSH sans qu'elles perdent leur
potentiel, ce qui freine leur utilisation dans des situations de greffes
autologues, compromet le transfert de gènes thérapeutiques et s'oppose à la
création de " banques " de cellules souches primaires purifiées,
disponibles à la demande, telles qu'elles peuvent être envisagées pour
d'autres catégories de cellules souches. Ce problème de l'incompatibilité de
divisions cellulaires avec le maintien d'un potentiel est très spécifique des
cellules souches hématopoïétiques, et les distingue donc radicalement des
cellules souches nerveuses, ou mésenchymateuses.
C'est essentiellement l'exploration du fonctionnement de ces
CSH et la connaissance des signaux contrôlant leurs propriétés d'un point de
vue fondamental qui permettra de répondre à ces limitations, qui freinent le développement
de l'utilisation thérapeutique des CSH. Or, les caractéristiques des CSH
compliquent leur étude expérimentale : leur rareté (< 1/105 cellules
mononucléées), l'impossibilité de les purifier à homogénéité (absence de
critères phénotypiques), et l'impossibilité actuelle de les amplifier sans
entraîner simultanément leur différenciation, c'est-à-dire la perte de leurs
caractères " cellules souches ", rend extrêmement difficile le
travail à partir de cellules primaires de tissus adultes vivants. In vitro, il
n'est guère possible de maintenir une hématopoïèse active (c'est-à-dire la
production de cellules différenciées) au-delà de quelques semaines, et in
vivo, au-delà de 4-7 mois dans le modèle xénogénique des souris
immunodéficientes,
et ceci par épuisement des cellules souches initiales. Un des moyens de dépasser
ces difficultés serait l'utilisation de cellules embryonnaires humaines (voir
ci-dessous).
L'autre obstacle majeur est l'évaluation des conséquences
de la manipulation des CSH chez l'homme en l'absence de modèle expérimental
totalement satisfaisant, in vitro ou in vivo, permettant de reproduire les
propriétés des CSH humaines.
On peut arguer que de telles études fondamentales sont
possibles dans le système murin où existe un système de transplantation syngénique
in vivo très performant, et où
les cellules ES (embryonic stem cells) ont été largement utilisées, notamment
pour étudier les effets de la surexpression inappropriée (transgéniques), de
l'invalidation (knock-out) de gènes, ou de leur expression physiologique dans
le temps et l'espace (knock-in). Le fait est que beaucoup de nos connaissances
sur le contrôle de l'hématopoïèse proviennent de l'analyse de ces mutants.
Cependant, même si les étapes clefs de la prolifération et de la différenciation
des CSH murines et humaines sont probablement identiques, les acteurs de la régulation
fine des CSH diffèrent suffisamment dans ces deux espèces en ce qui concerne
la réponse aux molécules régulatrices (cytokines) pour que les résultats
obtenus chez la souris ne soient pas directement extrapolables à la
manipulation des cellules humaines. Signalons aussi que d'autres facteurs
entrent en jeu, comme la taille, la durée de vie qui sont très éloignés chez
l'homme et la souris. Dernier argument, les conditions de développement in
vitro des cellules ES murines et humaines sont totalement différentes, rendant
toute extrapolation risquée.
Pour essayer de pallier l'absence de modèle expérimental
mimant une transplantation in vivo à
long-terme chez l'homme, des modèles de transplantation de cellules humaines à
l'animal ont été proposés. Cette situation forcément xénogénique est donc
entachée d'artéfacts. Les cellules humaines sont injectées soit à des souris
immunodéficientes, soit in utero à des foetus de gros animaux (mouton).
Certes, on obtient un certain degré de chimérisme dans les deux cas, et ce à
long-terme, mais aucun de ces modèles ne permet d'évaluer l'ensemble des
propriétés des cellules hématopoïétiques de façon satisfaisante, et en
particulier la différenciation terminale des cellules y est très incomplète,
et la fonction des cellules, critère essentiel dans une optique thérapeutique,
ininterprétable.
Contribution potentielle de l'utilisation de cellules souches
embryonnaires humaines à la compréhension de l'hématopoïèse fondamentale:
Par analogie à ce qu'a apporté à la compréhension de l'hématopoïèse
murine l'utilisation de cellules souches embryonnaires, celle de cellules
embryonnaires humaines serait certainement d'un grand intérêt : un premier
avantage de ces cellules ES indifférenciées est leur obtention en grand
nombre, puisqu'elles se multiplient in vitro sans perdre leur propriété de
totipotence, et que l'induction de leur différenciation est contrôlable à
tout moment par l'expérimentateur. Un second avantage est la facilité avec
laquelle on peut modifier le génome de ces cellules, en surexprimant,
délétant,
ou remplaçant un gène d'intérêt, permettant d'en analyser les conséquences
sur la différenciation hématopoïétique. Il n'est pas exclu non plus
d'immortaliser certaines de ces cellules, soit à un stade indifférencié, soit
à une étape de différenciation qui aura été choisie. C'est cette
disponibilité de cellules homogènes et de potentiel identique qui fait la
valeur de ce matériel.
A condition que l'on soit capable d'amplifier les cellules ES
humaines comme l'ont été les cellules ES murines, et de mettre au point les
conditions de leur différenciation en cellules souches hématopoïétiques puis
en précurseurs matures des différentes lignées, ce qui demande un travail
d'adaptation technique, et n'est pas à l'heure actuelle publié, leur
utilisation permettrait d'avancer dans plusieurs directions :
Sur le plan fondamental :
·
Les cellules ES sont les seules cellules dans lesquelles on peut, à
l'heure actuelle, remplacer un gène par un autre à la même place (technique
de recombinaison homologue, théoriquement idéale pour une thérapie génique).
Cette approche n'est pas faisable dans les cellules primaires hématopoïétiques
;
·
Le caractère embryonnaire des cellules ES permettrait d'analyser les événements
moléculaires contrôlant la transition entre une cellule mésodermique
totipotente et une cellule souche hématopoïétique. Ces étapes ne sont pas
abordables chez l'adulte, mais leur connaissance est fondamentale pour l'avenir
si l'hypothèse se confirmait qu'existent, chez l'adulte, des cellules ayant
conservé un potentiel proche du potentiel totipotent des cellules embryonnaires
;
·
La possibilité d'analyser les gènes responsables du couplage entre
prolifération et différenciation qui caractérise très spécifiquement les
CSH. Leur identification ouvrirait
peut-être la voie à des stratégies dissociant ces deux propriétés ;
·
Les cellules ES peuvent établir in vitro un environnement embryonnaire
très permissif puisqu'à ce stade existe une amplification cellulaire maximale.
Cet environnement est donc probablement la source (1) de molécules régulatrices
(cytokines), qui ne seraient présentes qu'à l'état embryonnaire et seraient,
à ce stade seulement, responsables de l'amplification des CSH ; (2) de signaux
environnementaux contribuant à l'acquisition ou l'expression, par une cellule
souche adulte, par exemple hématopoïétique, d'un potentiel autre que celui du
tissu où elle réside, par exemple musculaire, ou hépatique. Il apparaît donc
essentiel d'identifier ces molécules.
Sur le plan thérapeutique :
Les 4 points fondamentaux abordés ci-dessus pourraient avoir
un intérêt thérapeutique certain : non seulement dans l'hypothèse futur(iste)
de l'utilisation des cellules ES elles-mêmes, mais également parce que les mécanismes
décryptés à partir de l'étude des cellules ES pourraient s'appliquer à des
cellules primaires adultes, être vérifiés et offrir ainsi une base pour de
nouvelles stratégies thérapeutiques visant à moduler le potentiel des CSH.
Parmi celles-ci,
·
S' il s'avérait possible de découpler prolifération et différenciation
dans le compartiment des cellules souches, du moins transitoirement, cela
pourrait être exploité pour amplifier des cellules souches hématopoïétiques
(cf. ci dessus) ;
·
Si des molécules d'origine embryonnaire essentielles à l'amplification
de cellules souches ou à l'induction de leur différenciation sont identifiées,
elles pourraient être testées sur
des cellules souches adultes et à terme contribuer à définir des conditions
spécifiques pour reconstituer tel ou tel tissu et à partir d'une seule
population de cellules souches de moelle osseuse par exemple.
Dans une perspective à plus long terme utilisant les
cellules ES elles-mêmes,
·
La recombinaison homologue évoquée ci-dessus, suivie d'une
amplification sélective des cellules dans une voie tissulaire donnée, aurait
un intérêt pour corriger un tissu malade ;
·
Le caractère embryonnaire des cellules peut aider à minimiser une réaction
immunologique dans une situation de greffe.
Il ne faut pas nier les difficultés inhérentes à la
manipulation des cellules ES en général : certaines sont inhérentes à ce matériel
(différenciation in vitro incomplète, difficultés de culture, rapidité d'évolution,
cycle cellulaire très particulier, impossibilité de reconstituer le système hématopoïétique
d'une souris irradiée après injection de
cellules ES), d'autres, plus inattendues et récemment révélées, semblent spécifiques
des cellules ES humaines, dont la culture in vitro apparaît
beaucoup plus délicate que celle des cellules ES murines. Ceci pourrait
indiquer que la régulation de ces cellules dans les deux espèces diffèrent
profondément, et inciter à analyser ces différences. Il est donc essentiel
compte tenu de la limitation des approches expérimentales sur les cellules
primaires adultes chez l'homme, et de la divergence évoquée avec les cellules
ES murines, de pouvoir étudier, si cela s'avère techniquement possible, le
potentiel hématopoïétique cellules ES humaines .
QS 8- Voie d'accès au tissu cible :
D'un point de vue pratique, la greffe de CSH ne pose aucun
problème : les cellules " donneur " sont très facilement collectées,
et la greffe se fait par voie intraveineuse. En effet, les CSH retournent
d'elles-mêmes dans le tissu médullaire, le colonisent et y prolifèrent. Si
ceci est vrai des CSH obtenues à partir de donneurs adultes, il n'en est
probablement pas de même des cellules souches embryonnaires, d'après les données
obtenues chez la souris. Soulignons à ce propos que l'étude des mécanismes de
migration cellulaire qui contrôlent ce " homing " spécifique des
cellules CSH vers le tissu médullaire est aussi essentiel dans l'avenir à l'amélioration
des techniques de greffe de CSH.
QS 9 : Utilité thérapeutique des cellules souches présentes dans la moelle osseuse :
Il est préférable dans ce paragraphe de considérer non pas
les cellules souches hématopoïétiques, mais la moelle osseuse en tant que
tissu utilisable.
Cellules souches hématopoïétiques :
il existe trois
situations pathologiques où les CSH sont utilisées dans un but thérapeutique
:
·
Greffes allogéniques à partir des cellules d'un donneur apparenté sain
: remplacement des CSH déficientes ou trop peu nombreuses,
· Greffe autologue de cellules hématopoïétiques, pas nécessairement
" souches ", pour pallier les conséquences néfastes de la chimiothérapie
+ radiothérapie. Dans ce cas, il s'agit d'une démarche " transfusionnelle
" surtout utilisée dans le traitement des tumeurs solides,
·
Remplacement d'un gène déficient ou manquant par transfert de gènes
dans des cellules souches hématopoïétiques autologues. Cette approche ne
s'applique pour l'instant qu'à des pathologies très sélectionnées où existe
un avantage prolifératif des cellules transduites.
Autres cellules souches : La moelle osseuse contient au moins
trois autres populations intéressantes en thérapeutique :
-
Les cellules souches mésenchymateuses qui, après leur
amplification, peuvent être utilisées pour des reconstructions
ostéoarticulaires,
-
Des cellules participant à la régénération des cellules
hépatiques, et du muscle.